Développer et valider une méthode de dosage de benzodiazépines et de métabolites dans le plasma (ou le sérum).

Au total, 50μL de plasma, 50μL d’étalon interne (0,5μg/mL de diazépam-D5 dans de l’eau) et 200μL d’un mélange 1:1 de méthanol et d’acétonitrile sont mélangés et incubés pendant 30minutes à −20°C. Après centrifugation, 100μL de surnageant est transféré et 1μL est injecté. Le système analytique consiste en un UHPLC Thermo Ultimate 3000 couplé à un Thermo Q-Exactive. La colonne est une Thermo Accucore phényl hexyl 100×2,1mm, 2,6μm. La phase mobile consiste en un gradient d’A (H₂O, NH₄HCOO 2mM, 0,1 % HCOOH) et B (NH₄HCOO 2mM, MeOH/ACN 50/50, 0,1 % HCOOH, 1 % H₂O), de 25 à 90 % en 7,5minutes. La détection se fait en full-scan de m/z 150 à 500, avec entre 4 et 5minutes fragmentation en mode multiplex pour différencier les isomères clobazam/témazépam et norclobazam/oxazépam. Les calibrateurs sont ClinCal^® Benzodiazepines Serum Calibrator Set (niveaux 0–3) et les contrôles ClinCheck^® Serum Benzodiazepines (Recipe). La méthode permet le dosage de 33 molécules : 7-aminoclonazépam, 7-aminoflunitrazépam, 7-aminonitrazépam, 4-hydoxyalprazolam, 4-hydroxymidazolam, 4-hydroxytriazolam, alprazolam, bromazépam, chlordiazépoxide, clobazam, clonazépam, démoxépam, desalkylflurazépam, desméthylflunitrazépam, diazépam, estazolam, flunitrazépam, flurazépam, lorazépam, lormétazépam, médazépam, midazolam, nitrazépam, norclobazam, nordiazépam, oxazépam, prazépam, témazépam, tetrazépam, trazodone, triazolam, zaléplon et zolpidem. La validation a été effectuée selon les recommandations de l’Agence européenne des médicaments.

Aucune interférence n’a été détectée dans 3 plasmas et 3 sérums de volontaires. Aucune contamination entre échantillons n’a été constatée. Les limites inférieures de quantification (LLOQ) variaient entre 3,1 (triazolam) et 221 (norclobazam) μg/L. La répétabilité (4 concentrations, n=5) variait entre 0,5 % et 15,0 % (médiane : 2,2 %). La fidélité intermédiaire (4 concentrations, n=6) était en dessous de 15 % (LLOQ : 20 %) pour 28 molécules (médiane : 9,4 %). Elle était plus élevée pour le desalkylflurazépam (≤16 %), OH-alprazolam (LLOQ≤23 %), lorazépam (LLOQ≤24 %), lormétazépam (61 % !) et témazépam (≤22 %). La justesse était entre 85 et 115 % pour toutes les molécules testées, sauf le lorazépam et le lormétazepam (probablement à cause de problèmes de stabilité). La linéarité était excellente (r>0,998 pour toutes les molécules testées) jusqu’à par exemple 7400μg/L pour le nordiazépam. L’effet de matrice variait entre 106 et 115 %, avec une médiane à 108 %, avec des coefficients de variation inter-sujets entre 0,4 et 11,2 % (médiane 2,2 %). Toutes les molécules testées étaient stables pendant au moins 14jours à 4°C, sauf le lormétazépam. À la température ambiante l’oxazépam n’était stable que pendant 7jours, le clonazépam, (nor)flunitrazépam, lorazépam et nitrazépam moins longtemps. Tous les composés étaient stables après 3 cycles de décongélation/congélation.

La méthode permet le dosage de 33 molécules sur un échantillon de 50μL. Tous les critères de validation étaient satisfaits pour 28 molécules. Les raisons de la fidélité intermédiaire plus élevée pour certaines molécules doivent être étudiées plus en détail.